免疫組織化學(immunohistochemistry)又稱免疫細胞化學(immunocytochemistry)，是指帶顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應，對相應抗原進行定性、定位、定量測定的一項技術。它把免疫反應的特異性、組織化學的可見性巧妙地結合起來，借助顯微鏡(包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡)的顯像和放大作用，在細胞、亞細胞水平檢測各種抗原物質(如蛋白質、多肽、酶、激素、病原體以及受體等)。

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一、基本原理

抗體和抗原之間的結合具有高度的特異性，免疫組織化學正是利用了這一原理。先將組織或細胞中的某種化學物質提取出來，以此作為抗原或半抗原，通過免疫動物后獲得特異性的抗體，再以此抗體去探測組織或細胞中的同類的抗原物質。由于抗原與抗體的復合物是無色的，因此還必須借助于組織化學的方法將抗原抗體結合的部位顯示出來，以其達到對組織或細胞中的未知抗原進行定性，定位或定量的研究。

幾種常用的免疫組織化學方法的原理

免疫熒光細胞化學技術

將已知抗體標上熒光素,以此作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原,在熒光顯微鏡下觀察.當抗原抗體復合物中的熒光素受激發光的照射后會發出一定波長的熒光,從而可以確定組織中的抗原定位或定量.

免疫酶細胞化學

是目前免疫組織化學研究中zui常用的技術.基本原理是先以酶標記的抗體與組織或細胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對細胞或組織內的相應抗原進行定位或定性研究.

免疫膠體金技術

就是用膠體金標記一抗，二抗或其他的能特異性的結合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作為探針，對組織或細胞內的抗原進行定性，定位或定量研究.由于膠體金的電子密度高，多用于免疫電鏡的單標記或多標記的定位研究.

免疫組織化學的全過程包括：①抗原的提取與純化;③免疫動物或細胞融合，制備特異性抗體以及抗體的純化;③將顯色劑與抗體結合形成標記抗體;④標本的制備;③免疫細胞化學反應以及呈色反應;⑧觀察結果。

二、免疫組織化學基本技術

1.材料

免疫組織化學可用于多種材料.如實驗動物,人體組織,細胞和體外培養細胞都可用于免疫組化研究.

一.)實驗動物　種類很多，以狗，兔，大鼠和小鼠zui為常用.關鍵是取材迅速，大小適宜，固定充分.

二.)人體材料　包括活檢和手術切除的標本，以及通過各種手段收集的細胞都可用于免疫組化研究.如　脫落細胞　穿刺涂片　骨髓涂片　血涂片等.

三.)體外培養的細胞標本　根據所培養細胞的生物學特性采用不同的方法.對于貼壁生長的細胞可采用在培養瓶或培養皿底部放置載玻片，讓細胞在其上面生長，到時將載玻片取出進行固定，染色.懸浮生長的細胞可采用離心涂片或離心后細胞團塊固定，脫水，包埋，切片的方法進行免疫組織化學研究。

2 .固定

固定的目的在于保持組織的形態和結構的完整，盡量保存組織中的抗原，使其不被破壞或擴散，以減少非特異性染色或假陽性，假陰性的結果.

選擇固定方法的原則是:

在保持組織形態的完好和被檢測抗原的前提下,盡量應用濃度zui低的固定劑及zui短的固定時間.

常用固定劑

一.)醛類固定劑 起作用是使組織之間相互交聯,將抗原保存在原位.此類固定劑的特點是對組織的穿透力強,組織收縮性小.常用的有甲醛,多聚甲醛和戊二醛.可單用也可聯合使用.

(1)3% 中性甲醛固定液液:

配制: 30%甲醛10ml, 0.01mol/L PH 7.4 PBS 90ml

特點: 滲透性好,能完好地保護組織結構和某些抗原.由于交 聯作用會影響細胞膜的通透性,會遮蔽部分抗原,染 色 前用酶消化,以暴露抗原決定簇.

(2)4%多聚甲醛緩沖液:

配制: 40g多聚甲醛溶于0.1mol/L PBS 500ml, 加熱 攪拌(注意不要沸騰)至溶液清亮后，室溫下冷卻后加PBS, 使總容量為1000ml

特點：此固定劑對抗原的保護優于甲醛緩沖液但價格高與甲醛

(3)戊二醛-多聚甲醛緩沖液

配制：在上述溶液中加入1%的戊二醛.

特點：多用于電鏡的免疫組織化學研究

(4)Bouin液

配制：40%甲醛250ml，冰醋酸50ml,飽和苦味酸750ml.

特點：穿透力強，組織收縮小. 比單獨用甲醛固定更適合于免疫組織化學研究

(5) PLP液 (過碘酸-賴氨酸-多聚甲醛固定液)

此固定劑比較適合富含糖類組織的固定,對超微結構及許多抗原的保存均較好, 但配制比較繁瑣

二.)丙酮及醇類固定劑

固定原理是使組織中的蛋白質和糖類沉淀.此類固定劑的穿透能力強,對抗原保存較好,但對小分子蛋白質及多肽等物質的保存效果較差.常與其他固定劑 如 冰醋酸,乙醚,氯仿等混合使用.

(1)AAA液: 純酒精85ml，冰醋酸5ml，濃甲醛10ml

(2)Clzrke液：純酒精95ml，冰醋酸5ml 多用于冰凍切片的后固定

(3)Carnoy液: 純酒精60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml. 多用于癌基因蛋白，抗癌基因蛋白等抗原 的固定保存。

(4) 丙酮：常用于冰凍切片和細胞涂片的后固定。用前在4度冰箱預冷，切片在冷丙酮中固定5～10min.

三.)其他固定劑

(1) Zenker液 適合免疫球蛋白抗原的檢測。

(2) 四氯化鋨液 是電鏡研究中所必需的固定液

選擇*固定劑的標準是：

組織形態保存良好; zui大限度地保存抗原的抗原性。中性甲醛和多聚甲醛是應用zui廣的固定劑。

3. 包埋

包埋的目的是使組織保持一定的形狀和硬度，便于用切片機切片.常見的包埋劑及方法如下:

石蠟包埋 石蠟是組織病理切片中zui常用的包埋劑. 需要脫水, 透 明,浸臘等過程.

冰凍包埋 是作冰凍切片的包埋方法. 新鮮的及以固定的材料均 適合于冰凍包埋. 常用的包埋劑是OCT

塑料包埋 常用的是環氧樹脂包埋劑. 優點是同時可以作光鏡和 電鏡觀察

碳臘包埋 較少用.包埋劑為聚乙二醇

4. 切片

因為免疫組化的步驟較多, 要求切片薄而且平整, 否則在染色過程中容易脫片.一般要求片厚在4um以下。貼片前普通的載玻片要作適當的處理。

(1)洗片 酸液浸泡過夜，流水沖洗，蒸餾水洗，95%酒精浸

泡 2h，擦干。

(2)涂膠 常用的防脫片劑有：多聚賴氨酸，APES及白乳膠。

使用方法見試劑使用說明書。

三、常用的免疫組織化學方法

自從1941年Coons及其同事*免疫組織化學技術以來，伴隨著免疫學和組織化學理論與技術的發展，從zui初的直接法, 到現在的各種間接法的發展, 免疫組織化學發生了日新月異的變化.現在就從zui初的直接法開始到現在常用的免疫組織化學方法作一簡單介紹.

一. ）直接法: 是zui早出現的方法,是將酶直接標記在特異性抗體上,與標本中的抗原結合,讓酶催化底物反應產生有色物質,可以在光鏡下檢測. 直接法放大作用小,不夠敏感, 且標記一種抗體只能檢測一種抗原,所以應用就受到了限制.

二. ）間接法

是將酶標記在第二抗體上,形成抗原/一抗 /二抗-酶復合物,zui后酶底物顯色來放大信號. 由于一抗多來源于兔,小鼠或山羊等有限的幾種動物,所以僅需制備酶標記的一抗來源的IgG就可以檢測很多的抗體,放大效果也有所提高.為了追求更大的放大效果,人們有發明了PAP的橋聯法,雖然敏感性有所提高,但是同時出現了較高的非特異性背景,及假陽性等問題.隨后被生物素-卵白素系統所取代。

三. ）生物素-卵白素系統 (親和免疫組織化學)

生物素(biotin)是一種244Da的小分子的維生素。卵白素(avidin)又稱作抗生物素是一種68kDa的糖蛋白。生物素與抗生物素有很強的親合力，兩者一旦結合就很難解離。同時，生物素和抗生物素都具有與其他示蹤劑，如熒光素，過氧化物酶等相結合的能力。近年來，應用這一系統特性，研制出了許多檢測方法，如ABC法，SP法等。