組織游離膽固醇測試盒（酶法）(Tissue free cholesterol )

描述：在實體組織和細胞內，膽固醇酯既是構成細胞質膜的成分，也是細胞內脂滴的主要組分。細胞內膽固醇過度聚集與動脈粥樣硬化泡沫細胞形成密切相關。實體組織和細胞的膽固醇測定遠比血液膽固醇測定復雜。本試劑盒避免了有毒的有機溶劑抽提、繁雜的氮氣吹干和脂質復溶等步驟，采用高效能試劑裂解細胞和提取膽固醇，優化了酶學反應和操作步驟，簡單易行，靈敏度高，線性范圍20~5000 µmol/L。

原理：本試劑盒采用WHO、中國《全國檢驗操作規程》的酶學方法，結合經典GPO Trinder酶學反應^1,2，原理如下：(1) 膽固醇酯酶分解膽固醇酯為游離膽固醇。(2) 膽固醇氧化酶將游離膽固醇氧化，反應過程產生過氧化氫。(3) 在過氧化物酶催化下進行生色反應，在550nm有大吸收峰，光密度值與膽固醇濃度成正比。

參考文獻

1、Trinder P. Ann. Clin. Biochem. 1969, 6: 24-27.

   2、Barham D and Trinder P. Analyst. 1972, 97: 142-145

適于測定樣品：(1) 動物實體組織     (2) 培養細胞      (3) 細胞膜組分

組成 (105次微板測定或30次1 ml比色杯測定)：

(1)    裂解液 50 ml    (2)R1試劑 16 ml    (3)R2試劑 4 ml     (4)5 mmol/L膽固醇標準品0.5 ml

儲存：4 ºC，儲存三個月

所需設備：酶標儀、生化分析儀或721、722型可見光分光光度計。佳工作波長550nm，如無此波長建議優先選用570nm、次選530、490nm。

操作步驟；

一. 組織細胞裂解:

裂解前，組織或細胞用PBS洗滌2次去除殘存血液或培養基血清，以免影響膽固醇測定。

1)      培養細胞裂解：

消化、離心收集細胞或直接在培養皿內裂解。通常6孔板單孔約2x10⁶個細胞，75cm²瓶約1x10⁷細胞。按比例每1x10^6個細胞加0.1ml裂解液，震蕩混勻，靜置10分鐘。

2)      細胞膜成分：

每5x10⁶細胞制備的細胞膜組分，加入0.1-0.2ml裂解液（應根據預實驗調整裂解液的量），震蕩混勻，靜置10分鐘。

      3)     動物組織裂解：

切記要預先將新鮮組織剪切稱重后再進行保存。組織凍存后再進行解凍、剪切、稱重可能會產生嚴重的測量誤差。離心管精確稱重，加入組織塊后再稱重，二者相減(即減量稱重法)計算組織重量(約100mg)。強烈建議按比例每1mg組織加10µl裂解液以減少樣品間蛋白和脂質含量變異而產生的誤差。（注意；裂解液用量在1ml或更多可保證有效的裂解與脂質提取）。用電動高速勻漿器或手動玻璃勻漿器破碎組織。（不超聲方法，因其不能*和均勻破碎。應根據預實驗調整初始的組織細胞加入量），而后靜置10分鐘。

二. 組織細胞裂解液處理

1.    取適量上清液轉移到1.5ml離心管，進行步驟2的操作。余下的裂解液用BCA法蛋白定量試劑盒進行蛋白含量測定，或－20ºC儲存。

2.    可選的優化步驟：70ºC加熱10分鐘，可能出現絮狀沉淀。（此步驟即可在組織量多、膽固醇含量高時采用）。

3.    室溫2000g離心5分鐘，取上層清液用于酶學測定。

注意：如果得到上清的上層有較多的白色乳濁樣小顆粒，重復步驟2和3。

三、工作溶液配制: 按4:1比例，取4 ml試劑R1與1 ml試劑R2混勻，立即使用或4ºC保存<1天，變色棄去。

四、標準品稀釋：將5 mM膽固醇標準品用無水乙醇稀釋為2500、1250、625、312.5、156、78、39µmol/L。通常稀釋4個點即可。注意設置零濃度空白對照管。

五、含量測定：

1.    取190 µl工作溶液加入微板。

2.    在各工作液中，分別加入10 µl (5~10µl) 空白對照溶液（無水乙醇或蒸餾水均可）、標準品、待測樣品。樣品體積不可超過20µl。如測量值超過線性范圍可用裂解液稀釋，根據稀釋倍數計算濃度。

3.    37ºC或25ºC室溫反應20分鐘然后進行測定。（延長反應時間可能使游離膽固醇值增加，進而使游離膽固醇的數值與總膽固醇值接近。）

4.    先用蒸餾水（或無水乙醇）+工作液的空白管調零，然后測定各管OD值。

5.    繪制標準曲線并計算濃度。

Excel作圖步驟：各標準管OD值為y軸，標準品濃度為x軸。(1)鼠標左鍵圈住數據，點擊-做圖向導-，選擇-散點圖-，點擊-完成-。(2)鼠標右鍵點圖上的某一點，點擊 -添加趨勢線-，點擊 -選項-，點擊 -顯示公式-和 -R²值-。

6.    以每mg蛋白濃度或細胞數校正膽固醇含量。

組織膽固醇酯測定：需同分別測定組織總膽固醇和游離膽固醇，二者的差值即為膽固醇酯含量，參見以下說明。

說明：

1. 維生素C>0.18g/L、血紅蛋白>2g/L、還原劑二硫蘇糖醇、巰基乙醇、高濃度EDTA干擾測試。

2. 不同類型的組織細胞內總膽固醇和游離膽固醇的比例差異很大。延長反應時間可能使游離膽固醇值增加因而使其值與總膽固醇值接近。由差值計算求得的膽固醇酯的值，主要適合血液樣品測定，可能不很適合細胞內膽固醇酯測定。其原因主要與細胞內膽固醇酯和游離膽固醇的合成、轉運、外流、儲存、分解、再酯化等諸多動態生物過程的非線性的高度復雜性有關，還與現有測量方法的局限性有關。膽固醇(酯)的含量以及代謝方式在肝細胞、巨噬細胞、肌肉細胞、成纖維細胞等不同類型的細胞中存在巨大差異。有時以差值計算的膽固醇酯出現背離和偏差，甚至為負值。如果出現這種情況，建議在數據分析時采用膽固醇酯/總膽固醇比值，而非膽固醇酯絕對值；或者嘗試用同位素標記方法、薄層層析、HPLC等方法測定膽固醇酯，或許會有改善。