蛋白質測定的要點

蛋白質測定的原理和方法

一、飲料中蛋白質的測定

1、原理：同“糧油及其制品中蛋白質的測定”中的常量凱氏定氮法。

2、儀器：同“糧油及其制品中蛋白質的測定”中的常量凱氏定氮法。

3、試劑：同“糧油及其制品中蛋白質的測定”中的常量凱氏定氮法。

4、測定方法：準確吸取飲料樣品10~20ml，移入干燥潔凈的500ml凱氏燒瓶中，加入研細的CuSO40.5g、K2SO410g和濃H2SO420ml，輕輕搖勻，安裝消化裝置，并將其以45°斜支于有小孔的石棉網上。用電爐以小火加熱，待內容物全部炭化、泡沫停止產生后，加大火力，保持瓶內液體微沸，液體變藍綠色透明后，再繼續加熱微沸30min。冷卻，加入200ml蒸餾水，再放冷，加入玻璃珠數粒以防蒸餾時爆沸。

二、糧油及其制品中蛋白質的測定

蛋白質的測定方法一般是根據蛋白質的理化特性來確定的，主要分為兩類：一類是利用蛋白質共性的方法，例如凱氏法、雙縮脲法等；另一類是利用蛋白質中含有特定氨基酸殘基的方法，例如酚試劑法、紫外光譜吸收法、色素結合法等。

在糧食品質分析中應用zui普遍的是凱氏法。該法是1883年由丹麥化學家凱道爾創立的，適宜于測定任何形態的樣品，而且具有很高的準確度和精密度，一直被作為蛋白質定量的標準方法。近幾年來對凱氏法進行了多方面的改進，目前正向自動檢測方面發展。

1、常量凱氏定氮法

1）原理：將含有蛋白質的樣品與濃H2SO4共熱，其中的氮變成銨鹽狀態后再與濃堿作用，放出的氨用酸吸收，滴定剩余的酸，即可算出含氮量。具體測定步驟可用消化、蒸餾、吸收與滴定來概括。

消化是指將蛋白質與濃H2SO4混合加熱，蛋白質被分解，其中的碳被氧化成CO2，所含的氮則轉變成氨，并與H2SO4化合形成硫酸銨殘留于消化液中。

2NH2（CH2）2COOH＋13H2SO4 ＝（NH4）2SO4＋6CO2＋12SO2＋16H2O

由于上述反應進行很慢，消化需要很長時間，加入催化劑可加快反應速度，CuSO4是常用的催化劑，K2SO4能提高溶液的沸點，常將它們混合使用，起加速氧化、促進有機物分解的作用。K2SO4的用量不宜過大，否則溫度過高，生成的（NH4）2SO4會分解，放出氨，使氮損失。

蒸餾是將消化所得的（NH4）2SO4加堿蒸餾，氨又被釋放出來。

2NaOH＋（NH4）2SO4 ＝ 2NH3＋Na2SO4＋2H2O

需要注意的是加入NaOH溶液要過量，而且要防止樣液中NH3的逸出。可用CuSO4作堿性指示劑，以黑色CuO出現為宜

吸收與滴定是將生成的氨用標準HCl吸收，剩余的未被中和的HCl則用標準NaOH溶液滴定。所用HCl的摩爾數減去滴定所消耗的NaOH的摩爾數，就是被吸收氨的摩爾數

生成的氨也可直接用硼酸溶液吸收。硼酸吸收氨后，指示劑的顏色變化，再用HCl滴定，直至恢復到原來的氫離子濃度為止，用去HCl的摩爾數即相當于樣品中氨的摩爾數

2NH3＋4H3BO3 ＝ （NH4）2B4O7＋5H2O

（NH4）2B4O7＋5H2O＋2HCl＝2NH4Cl＋4H3BO3

由于各種蛋白質中氮的質量分數通常為16%左右，將氮的質量分數乘以蛋白質系數，即得粗蛋白質的質量分數。

2）儀器：凱氏燒瓶（500ml）、錐形瓶（250ml）、定管（50ml）、移液管（50ml）、量筒（100ml）、定氮蒸餾裝置

3）試劑：濃、甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑：5份1g/l溴甲酚綠乙醇溶液與1份甲基紅乙醇溶液，按5：1體積臨用時混合、40g/l硼酸吸收液：稱取20g硼酸溶解于500ml熱水中，搖勻備用、0.1000mol/L HCl標準溶液

4）操作方法

準確稱取固體樣品0.2~2g（半固體樣品2~5g，液體樣品10~20ml），小心移入干燥潔凈的500ml凱氏燒瓶中，加入研細的CuSO40.5g，K2SO410g和濃H2SO420ml，輕輕搖勻，安裝消化裝置，并將其以45°斜支于有小孔的石棉網上。用電爐以小火加熱，待內容物全部炭化、泡沫停止產生后，加大火力，使瓶內液體微沸，液體變藍綠色透明后，再繼續加熱微沸30min。冷卻，小心加入200ml蒸餾水，再放冷，加入玻璃珠數粒以防蒸餾時爆沸。

將凱氏瓶安裝好蒸餾裝置，塞緊瓶口，冷凝管下端插入吸收瓶液面下（瓶內預先裝入50ml40g/l硼酸吸收液及混合指示劑2~3滴）。放松夾子，通過漏斗加入70~80ml400g/LNaOH溶液，并搖動凱氏燒瓶，瓶內溶液變為深藍色或產生黑色沉淀后，再加入100ml蒸餾水（從漏斗中加入），夾緊夾子，加熱蒸餾，至氨全部蒸出（餾液約250ml即可），將冷凝管下端提離液面，用蒸餾水沖洗管口，繼續蒸餾1min，用表面皿接幾滴餾出液，以奈氏試劑檢查，若無紅棕色物生成，表示蒸餾完畢，即可停止加熱。否則應繼續蒸餾。將上述吸收液用0.1000mol/L HCl標準溶液直接滴定至灰色即為終點，記錄HCl標準溶液的用量。同時做空白試驗（除不加樣品外，其他操作*相同），記錄空白試驗消耗HCl標準溶液的體積。

5）結果計算

蛋白質質量分數的計算公式為w（蛋白質）＝〔M×F×c(v1－v2) ×100〕/（1000×m）＝〔F×c(v1－v2) ×1.4〕/ m       式中：      w(蛋白質)——蛋白質的質量分數（%）   m——樣品的質量 （g）    M/14——氮的摩爾質量 （g/mol） c——HCl標準溶液的濃度 （mol/L）  v1——滴定樣品吸收液時消耗HCl標準溶液的體積 （ml）   v2——滴定空白吸收液時消耗HCl標準溶液的體積 （ml）   F——氮換算為蛋白質的系數

蛋白質中氮的質量分數一般為15~17.6%，按16%計算乘以6.25即為蛋白質的質量分數。蛋白質系數：乳制品為6.38；肉及其制品為6.25；玉米、高粱為6.24；米為5.95；大麥、小米、燕麥、裸麥為5.83；大豆及其制品為5.71；面粉為5.70；花生為5.46；芝麻、向日葵為5.30

6）注意事項

蒸餾裝置不能漏氣；蒸餾前若加堿量不足，消化液呈藍色，不生成Cu（OH）2沉淀，此時需增加NaOH的用量；硼酸吸收液的溫度不應超過40℃，否則對氨的吸收作用減弱而造成損失，此時可置于冷水浴中使用；蒸餾完畢后，應先將冷凝管下端提離液面清洗管口，再蒸1min后關掉熱源，否則可能造成吸收液倒吸；所有試劑溶液應用無氨蒸餾水配制；消化時不要用強火，應保持和緩沸騰，注意不斷轉動凱氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘渣洗下并促進其消化*；樣品中若含脂肪或糖較多時，消化過程中易產生大量泡沫，為防止泡沫逸出瓶外，在開始消化時應用小火加熱，并不斷搖動；也可以加入少量的辛醇、液體石蠟或硅油消泡劑，并同時注意控制熱源強度；當樣品消化液不易澄清透明時，可將凱氏燒瓶冷卻，加入30%（體積分數）H2O22~3ml后再繼續加熱消化；若取樣量，如干試樣超過5g，可按每克試樣5ml的比例增加H2SO4用量；一般消化至呈透明后，繼續消化30min即可，但對于含有特別難以消化的氮化合物的樣品，如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等時，需延長消化時間。有機物若分解*，消化液呈藍色或淺綠色，但含鐵量多時，呈較深綠色；混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。

2、微量凱氏定氮法

1）原理：同常量凱氏定氮法

2）儀器和用具：凱氏燒瓶（100ml）、萬用電爐、微量滴定管（10ml）、移液管（10ml）、容量瓶（100ml）、洗耳球、乳膠管、微量凱氏定氮蒸餾裝置

3）試劑：0.01000 mol/L HCl標準溶液：其他試劑同常量凱氏定氮法

4）操作方法：樣品消化步驟同常量凱氏定氮法

將消化*的溶液冷卻后，全部移入100ml容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻。裝好微量定氮裝置。量取消化稀釋液10ml置于反應管內，經漏斗再加入10ml400g/LNaOH溶液使其呈強堿性，用少量蒸餾水沖洗漏斗數次，夾好漏斗夾，進行水蒸氣蒸餾。冷凝管下端預先插入盛有10ml40g/l（或20 g/l）硼酸吸收液的液面下。蒸餾至吸收液中所加的混合指示劑變為綠色開始計時，繼續蒸餾10min后，將冷凝管下端提離液面再蒸餾1min，用蒸餾水沖洗冷凝管尖-端后停止蒸餾。餾出液用0.01000 mol/L HCl標準溶液滴定至灰色為終點。同時做空白試驗。

5）結果計算

樣品中蛋白質質量分數的計算公式為

w（蛋白質）＝｛〔F×c(v1－v2) ×14 ×100〕/1000｝/〔（10×m）/100〕

＝F×c(v1－v2) ×14/m          式中：      w(蛋白質)——樣品中蛋白質的質量分數（%）  m——樣品的質量或體積 （g）    14/ M——氮的摩爾質量 （g/mol）    c——HCl或 H2SO4標準溶液的物質的量的濃度 （mol/L）      v1——樣品消耗HCl或 H2SO4標準溶液的體積 （ml）     v2——試劑空白消耗HCl或 H2SO4標準溶液的體積 （ml）      F——氮換算為蛋白質的系數

6）說明

         20 g/L硼酸吸收液每次用量25ml，用前加入甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑2滴；在蒸餾時，蒸汽發生要均勻充足，蒸餾過程中不得停火斷氣，否則將發生倒吸；加堿要足量，操作要迅速；漏斗應采用水封措施，以免氨由此逸出損失；雙試驗結果允許誤差：粗蛋白質的質量分數在15%以下時，不超過0.2%；蒸餾前將水蒸氣發生器內裝水至2/3體積處，加甲基橙指示劑數滴及H2SO4數毫升以使其始終保持酸性，可避免水中的氨被蒸出而影響測定結果；粗蛋白質的質量分數在15%以上時，誤差不超過0.4%。求其平均數，即為測定結果，測定結果取小數點后一位。