教你如何計數霉菌酵母菌

檢驗方法




霉菌和酵母的計數方法，與菌落總數的測定方法基本相似。主要步驟為：
將樣品制作成10倍梯度的稀釋液，選擇2~3個合適的稀釋度，分別吸取1 mL于兩個無菌平皿，傾注培養基，培養后觀察，計數。
對番茄醬、番茄汁適用于第二法 霉菌直接鏡檢計數法，是采用顯微鏡直接鏡檢計數的方法。這個方法表達的是該食品是否存在加工前的腐-敗。


具體檢驗方法標準按照：
GB 4789.15－2016《食品安全國家標準　食品微生物學檢驗　霉菌和酵母計數》
 

真菌和酵母的介紹

酵母是真菌中的一大類，通常是單細胞，呈圓形、卵圓形、臘腸形或桿狀。

霉菌也是真菌的一種。一般把能夠形成疏松的絨毛狀菌絲體的小型真菌稱為霉菌。

霉菌和酵母廣泛分布于自然界并可作為食品中正常菌相的一部分。以來，人們利用某些霉菌和酵母加工一些食品，如用霉菌加工干酪和肉，使其味道鮮美；還可利用霉菌和酵母釀酒、制醬；食品、化學、醫藥等工業都少不了霉菌和酵母。


但在某些情況下，霉菌和酵母也可造成食品腐-敗變質。由于它們生長緩慢和競爭能力不強，故常常在不適于細菌生長的食品中出現，這些食品是pH低、濕度低、含鹽和含糖高的食品、低溫貯藏的食品，含有抗菌素的食品等 。由于霉菌和酵母能抵抗冷凍，以及抗生素和輻照等貯藏及保藏技術，它們能轉換某些不利于細菌的物質，而促進致病細菌的生長；有些霉菌能夠合成有毒代謝產物－霉菌毒素。霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。例如，酵母在新鮮的和加工的食品中繁殖，可使食品發生難聞的異味，它還可以使液體發生混濁，產生氣泡，形成薄膜，改變顏色及散發不正常的氣味等 。


因此霉菌和酵母也作為評價食品衛生質量的指示菌，并以霉菌和酵母計數來表示食品被真菌污染的程度。目前已有若干個國家制訂了某些食品的霉菌和酵母*。我國已制訂了一些食品中霉菌和酵母的*。




霉菌菌絲的特征：

平行壁：霉菌菌絲呈管狀，多數情況下，整個菌絲的直徑是一致的。因此在顯微鏡下菌絲壁看起來象兩條平行的線。這是區別霉菌菌絲和其他纖維時zui有用的特征之一。

橫隔：許多霉菌的菌絲具有橫隔，僅有毛霉、根霉等少數霉菌的菌絲沒有橫隔。

菌絲內呈粒狀：薄壁、呈管狀的菌絲含有原生質，在高倍顯微鏡下透過細胞壁可見其呈粒狀或點狀。

分枝：如菌絲不太短，則多數呈分枝狀，分枝與主干的直徑幾乎相同，有分枝是鑒定霉菌菌絲的可靠特征之一。

菌絲的頂端：常呈鈍圓形，無折射現象。



凡有以上特征之一的絲狀均可判定為霉菌菌絲。



觀察視野中有無菌絲，凡符合下列情況之一者為陽性視野。   

一根菌絲長度加上分枝的長度超過視野直徑1/6；

一根菌絲長度超過視野直徑1/6；   

兩根菌絲總長度超過視野直徑1/6；  

三根菌絲總長度超過視野直徑1/6；  

一叢菌絲可視為一個菌絲，所有菌絲（包括分枝）總長度超過視野直徑1/6。



根據對所有視野的觀察結果，計算陽性視野所占比例，并以陽性視野百分數（%）報告結果。


說 明



1．樣品的處理：為了準確測定霉菌和酵母數，真實反映被檢食品的衛生質量，首先應注意樣品的代表性。容易混勻的液體樣品可用迅速振搖樣品稀釋液容器25次來混勻。



對大的固體食品樣品，要用滅菌刀或鑷子從不同部位采取試驗材料，再進行均質。如樣品不太大，zui-好把全部樣品放到拍擊式均質器內均質1 min。由于霉菌絲狀結構的特性，使用旋轉刀均質器可能會導致較高的不真實計數結果。



2．樣品的稀釋：*值較嚴格的樣品，可以直接取原液進行檢驗。為了減少稀釋倍數的誤差，在連續遞增稀釋時，每一稀釋度應更換一根吸管。以前標準規定在稀釋過程中，為了使霉菌的孢子充分散開，需用滅菌吸管反復吹吸50次。現在實驗室條件較好，為了防止產生有害的氣溶膠并且減少操作污染，一般建議使用旋渦混合儀來充分混勻稀釋液。



3．培養基的選擇：在霉菌和酵母計數中，主要使用以下幾種選擇性培養基。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：霉菌和酵母在PDA培養基上生長良好。用PDA作平板計數時，必須加入抗菌素（國標使用的是氯霉素）以抑制細菌。但是這個培養基上霉菌容易蔓延生長，影響zui后的計數。

孟加拉紅（虎紅）培養基：該培養基中的孟加拉紅可抑制霉菌菌落的蔓延生長。孟加拉紅還在菌落背面由孟加拉紅產生的更深的紅色有助于霉菌和酵母菌落的計數。也需要加入抗菌素（國標使用的是氯霉素）抑制細菌的干擾。

高鹽察氏培養基：糧食和食品中常見的曲霉和青霉在該培養基上分離效果良好，它具有抑制細菌和減緩生長速度快的毛霉科菌種的作用。現在于飼料霉菌檢驗方法標準采用。



4．傾注培養：每個樣品應選擇3個適宜的稀釋度，每個稀釋度分別取2個1 mL加入2個平皿。同時吸取1 mL無菌稀釋液加入一個無菌平皿作為空白對照。培養基融化后冷卻至46 ℃，立即傾注并旋轉使稀釋液與瓊脂混勻，先向一個方向旋轉，再轉向相反方向，充分混合均勻。培養基凝固后，把平皿正置于溫箱培養。大多數霉菌和酵母在中等溫度的條件下生長良好，因此，美國FDA規定的培養溫度是25℃，我國規定的培養溫度是28 ℃。培養3 d后開始觀察菌落生長情況，共培養5 d。觀察第5天的計數結果，并記錄。如空白對照有菌落出現。此次試驗無效。



5．菌落計數及報告：選取菌落數10～150之間的平板進行計數。一個稀釋度使用兩個平板，取兩個平板菌落數的平均值，乘以稀釋倍數報告。固體檢樣以g為單位報告，液體檢樣以mL單位報告。關于稀釋倍數的選擇可參考細菌菌落總數測定。



6．霉菌直接鏡檢計數法：采用該方法，需要一片較為昂貴的霍華德霉菌計測片。沒有這個玻璃片，無法進行這個直接鏡檢的方法。

該方法將果醬或果汁稀釋到一定波美度后，涂布在霍華德霉菌計測片上。然后在顯微鏡下觀察，觀察50個視野里面是否有霉菌。要求兩個人進行此實驗。以100個視野觀察結果報告。