RT-PCR實驗外包，mRNA、miRNA、lncRNA、DNA實驗代測

服務內容：

1.制定個性化實驗方案：根據不同的實驗目的確定實驗方案、選定合適的內參；
2.檢測類別：mRNA、miRNA、lncRNA、DNA；
3.樣本抽提及質檢：對客戶提供樣本進行RNA抽提，并利用NanoDrop進行樣本質檢；
4.定量PCR預實驗：包括樣本反轉錄為CDNA、配置PCR反應體系及進行Real-TimePCR反應；
5.正式定量PCR實驗：根據預實驗結果進行正式實驗；
6.數據分析：采用2- △△CT法進行分析，比較不同樣本間差異。

服務要求：
1.請提供組織樣本，細胞樣本，血漿或血清樣本，totalRNA；
2.請提供已知的全長基因序列或GeneBank號；
3.請提供盡可能詳細的背景資料：DNA/RNA來源、基因豐度等。

結果內容：整理好的報告，樣本收到之日起5個工作日內反饋質檢結果。

結果展示：

樣本質檢圖

溶解曲線：

擴增曲線

數據統計

每個指標有2張圖。一張是擴增曲線，另一張是熔解曲線，用來證明PCR擴增中無非特異性擴增

送樣運輸要求：

1. 樣品處理

a. 動物組織：常規組織，脂肪組織，結締組織，纖維化組織適當增加。將組織剪切成合適大小后（建議組織塊長寬高均不大于0.5 cm），然后迅速浸泡于5～10倍體積的RNAsolidTM試劑中。（注意：已浸入RNAsolidTM試劑中的組織經平衡一段時間后，可從溶液中取出，切成更小的組織塊，再重新放回RNAsolidTM試劑中；有些比較弱的液體滲透性組織如骨頭等，不適合用RNAsolidTM試劑進行RNA保護。）

b.植物組織：新鮮的葉、果肉、種子最少100 mg。將嫩葉，嫩莖組織切成合適的大小（建議長寬高均不大于0.5 cm）后，然后迅速浸泡于5～10倍體積的RNAsolidTM試劑中。（注意：某些植物組織天生具有的屏障，如葉子表面的蠟層可阻礙RNAsolidTM試劑的滲透，對于此類組織，通常需破壞這些屏障層以允許溶液的浸透。）

c.細胞等樣本：收集不小于10^6個細胞的沉淀（用PBS清洗1-2次）。之后迅速加入5～10倍體積的RNAsolidTM試劑。

d.酵母、細菌等樣本：離心棄上清，收集小米粒大小的單菌體沉淀，然后迅速加入適量的RNAsolidTM試劑浸沒菌體沉淀。

e. RNA樣品： OD260/280為1.8-2.0，濃度≥100 ng/μL，體積≥20μL，干冰運輸。

f.cDNA：cDNA原液≥20 μL，干冰運輸。

2. 樣品保存及運輸

加入有RNAsolidTM試劑的樣本可在37℃保存1～2天，2天以后部分組織中的RNA會開始降解。室溫（25℃）穩定保存1周，不會有明顯的RNA降解發生。大部分樣品置于RNAsolidTM試劑中，4℃條件下可穩定保存1個月，不會有明顯的RNA降解發生。長期存放可先將保存在RNAsolidTM試劑中的樣本4℃浸透過夜，然后將RNAsolidTM試劑吸出棄去，再將樣本放入-20℃或-80℃長期穩定保存3～5年。

關于Real-time qPCR如何進行數據分析

1. Real-time qPCR常見參數

基線（baseline）

通常是3-15個循環的熒光信號

同一次反應中針對不同的基因需單獨設置基線

閾值（threshold）

自動設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍

手動設置：置于指數擴增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強

同一次反應中針對不同的基因可單獨設置閾值，但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。

Ct值:與起始濃度的對數成線性關系。

分析定量時候一般取Ct:15-35。太大或者太小都會導致定量的不準確。

Rn（Normalized reporter）是熒光報告基團的熒光發射強度與參比染料的熒光發射強度的比值。
△Rn：△Rn是Rn扣除基線后得到的標準化結果（△Rn=Rn-基線）。

2. 影響Ct值的關鍵因素

模板濃度

模板濃度是決定Ct的最主要因素。控制在一個合適范圍內，使Ct在15-35之間

反應液成分的影響

任何分子的熒光發射都受環境因素影響----比如溶液的pH值和鹽濃度。

PCR反應的效率

PCR反應的效率也會影響Ct值。在PCR擴增效率低的條件下進行連續梯度稀釋擴增，與PCR擴增效率高的條件下相比，可能會所產生斜率不同的標準曲線。PCR效率取決于實驗、反應混合液性能和樣品質量。一般說來，反應效率在90-110%之間都是可以接受的。

3. 如何評估實時定量PCR反應的效果

PCR擴增效率：為了正確地評估PCR擴增效率，至少需要做3次平行重復，至少做5個數量級倍數(5logs)連續梯度稀釋模板濃度。

另一個評估PCR效率的關鍵參數是相關系數R2，它是說明兩個數值之間相關程度的統計學術語。如果R2等于1，那么你可以用Y值（Ct）來準確預測X值（量）。如果R2等于0，你就不能通過Y值來預測X值。R2值大于0.99 時，兩個數值之間相關的可信度很好。

標準偏差（standard deviation，偏差的平方根）是的精確度計量方法。

如果許多數據點都靠近平均值，那么標準偏差就小；如果許多數據點都遠離平均值，則標準偏差就大。實際上，足夠多重復次數產生的數據組會形成大致的正態分布。這經常可通過經典的中心極限理論來證明，獨立同分布隨機變量在無限多時趨向于正態分布。如果PCR反應效率是 100%，那么2倍稀釋點之間的平均Ct間隔應該恰為1個Ct值。要以99.7%的幾率分辨2倍稀釋濃度，標準偏差就必須小于等于0.167。標準偏差越大，分辨2倍稀釋的能力就越低。為了能夠在95%以上的情況下分辨出2倍稀釋，標準偏差必須小于等于 0.250

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