Annexin V-FITCPI凋亡檢測試劑盒的操作說明

保存方式
4℃避光可保存12個月。

操作說明
1. 細胞樣品的準備：
a) 懸浮細胞：
1）收集細胞?離?管中1000-2000rpm離心5min，小心去除上清。
2）用1ml 4℃預冷PBS輕輕重懸細胞并計數，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。
3）再加?1ml 4℃預冷的PBS重懸細胞，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。
b) 貼壁細胞：
1）吸出細胞培養液至離?管中，PBS洗滌貼壁細胞?次，加?適量不含EDTA的細胞消化液消化細胞。
2）室溫孵育?輕輕吹打可以使貼壁細胞吹打下來時，吸除細胞消化液。需避免的過度消化。
3）加?以上步驟中收集的細胞培養液，稍混勻，轉移到離?管內，1000-2000rpm離?5min，??吸除上清。
注：加?的細胞培養液一方面可以收集已經懸浮的發?凋亡或壞死的細胞，另一方面細胞培養液中的?清可以有效抑制或中和殘留的；殘留的會消化并降解后續加?的 Annexin V-FITC 導致染?失敗。
4）?1ml 4℃預冷PBS輕輕重懸細胞并計數，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。
5）再加?1ml 4℃預冷的PBS重懸細胞，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。

2. ?去離??按1：4稀釋 Binding Buffer（4ml Binding Buffer+12ml去離??）；
3. 用 250ul結合緩沖液重新懸浮細胞，調節其濃度為1×106/ml；
4. 取100ul的細胞懸液于5 ml流式管中，加入5ul Annexin V-FITC，輕輕混勻；
5. 室溫(20-25℃)避光孵育10min；
6. 上機前5min加?10ul碘化丙啶溶液，輕輕混勻；
7. 上機前在反應管中補加400ul PBS重懸細胞，避光保存，隨即進?流式細胞儀（FACS）檢測， Annexin V-FITC為綠?熒光，PI為紅?熒光。如使用熒光顯微鏡，可直接觀察。

產品描述
磷脂酰（PS）是?種帶負電荷的磷脂，正常細胞中，PS只分布在細胞膜脂質雙層的內側，?在細胞凋亡早期，細胞膜PS由脂膜內側翻向細胞膜外側，使PS暴露在細胞膜外表?。Annexin V是?種分?量為35~36kD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋?，與磷脂酰有?度親和?，故可通過細胞外側暴露的磷脂酰與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此Annexin V被*為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之?。

本試劑盒將Annexin V進?綠?熒光（FITC）標記，以標記了的Annexin V作為探針，利?熒光顯微鏡或流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發?。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是?種核酸染料，它不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整的細胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和壞死細胞，PI能夠透過細胞膜?使細胞核染紅。因此采?Annexin V與PI雙染的?法，就可以將處于不同凋亡時期的細胞區分開來。

注意事項：
1. 微量試劑需離?數秒將試劑收集?管底后再開蓋取?。
2. Propidium Iodide（PI）、Annexin V-FITC有毒，操作時要帶?套，使?時避免與?膚，眼睛和黏膜接觸。
3. 本試劑盒?于檢測活細胞，流式細胞儀檢測時，細胞數量不應低于1x106。
4. 染?后宜盡快檢測，時間過?可能會導致凋亡或壞死細胞的數量增加。
5. Annixin V檢測凋亡細胞的?法適?于懸浮??的細胞，如：淋巴細胞等細胞的檢測。對于貼壁??的細胞，由于在等消化處理過程中會造成細胞膜的損傷，會造成較?的假陽性，而用細胞刮子會造成細胞粘連成團，從而影響檢測，可消化后的細胞保存在含2%BSA的PBS中，防?進?步的損傷。盡管?前，包括國外也有?些單位采?該?法檢測貼壁??的細胞。但不推薦，因為其重復性較差，且需要操作時?常??。
6. .細胞固定后可能導致熒光的淬滅，請不要固定樣品。
7. .如果樣品來源于血液，請務必除去血液中的血小板。因為血小板含有PS，能與Annexin V結合，從而干擾實驗結果。可以使用含有EDTA的緩沖劑并在200g離心洗去血小板。

 Annexin V-FITCPI凋亡檢測試劑盒的操作說明